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在傳統(tǒng)的小分子藥物研發(fā)中，決定靶點特異性與DMPK（分布、代謝和藥代動力學(xué)）的結(jié)構(gòu)特征往往密不可分，很難相互獨立的進行設(shè)計和優(yōu)化。與之不同，寡核苷酸類藥物的藥效團和藥代動力學(xué)性質(zhì)在理論上可以分別優(yōu)化，這是因為寡核苷酸類藥物的核苷序列直接決定前者，而其磷酸酯骨架的化學(xué)性質(zhì)很大程度上影響后者。目前，寡核苷酸類藥物有超過155項正在進行的臨床試驗，并已有多個獲批上市的藥物，其中大部分都含有修飾的磷酸酯骨架。遺憾的是，盡管有機合成的進步對現(xiàn)代藥物化學(xué)的發(fā)展產(chǎn)生了深遠的影響，但是隨著寡核苷酸序列和可能的磷酸酯骨架的范圍擴大，寡核苷酸合成的基本化學(xué)卻鮮有重大進步。如圖1所示，一段含有四種不同磷基連接結(jié)構(gòu)以及多種糖骨架的嵌合寡核苷酸序列，如果使用已有方法合成，所面臨的巨大困難也從某種程度上凸顯了現(xiàn)有方法的局限性，理想中可以隨意地以任何順序安裝更廣泛的組合和變化就顯得更加遙不可及。如此說來，寡核苷酸的商業(yè)化，更具體地說，廣受期待的硫代磷酸酯反義寡核苷酸（PS-ASO）的商業(yè)化面臨著重大挑戰(zhàn)。

2018年，美國斯克里普斯研究所（The Scripps Research Institute，TSRI）的Phil S. Baran教授與制藥巨頭百時美施貴寶（Bristol-Myers Squibb，BMS）的Ivar M. McDonald、Martin Eastgate、Michael Schmidt等研究者合作發(fā)展了一種基于P(V)的磷硫試劑（稱為PSI或ψ）來解決立體純硫代磷酸酯（R-PS和S-PS，主要在DNA環(huán)境下）寡核苷酸的合成問題（Science, 2018, 361, 1234–1238，點擊閱讀詳細(xì)）。然而，這項初步研究也有尚未解決的問題，比如其他類型磷酸酯骨架連接結(jié)構(gòu)如二硫代磷酸酯和天然磷酸二酯的安裝，如鎖核酸（LNA）的其他糖化學(xué)，以及對現(xiàn)代自動化合成的適用性。解決這些問題，要面對不少挑戰(zhàn)，比如：1）P(V)試劑曾被認(rèn)為反應(yīng)速率過于緩慢，無法與P(III)歧化相競爭；2）鳥嘌呤和胸腺嘧啶堿基的影響會導(dǎo)致不同的化學(xué)選擇性；3）使用現(xiàn)有基于P(III)的試劑來安裝二硫代磷酸酯連接結(jié)構(gòu)并不理想；4）當(dāng)前修飾磷酸酯骨架的方法步驟復(fù)雜，存在氧化與脫保護以及產(chǎn)物分離等問題。鑒于此，開發(fā)一種高度選擇性和兼容性的自動化寡核苷酸合成方法就顯得尤為重要，會對寡核苷酸類藥物的研發(fā)和商業(yè)化產(chǎn)生深遠影響。

在此前工作基礎(chǔ)上，Baran教授等人近日再獲重要進展。通過利用ψ2（3）、rac-ψ（4）和ψO（5）三種新試劑，并與已報道的[(+)-ψ, (+)-2]和[(?)-ψ, (?)-2]體系相結(jié)合，他們開發(fā)了一種完全不同于P(III)基寡核苷酸合成的通用P(V)平臺，實現(xiàn)了特定寡核苷酸序列的任意受控合成（圖1C）。該方法不僅能夠減少保護基化學(xué)的依賴、特殊試劑、氧化試劑等多個方面的問題，而且還去掉了標(biāo)準(zhǔn)固相寡核苷酸合成（SPOS）方案中的一個完整步驟（即磷氧化過程）。相關(guān)成果于近日發(fā)表在Science上。

相比于ψ2與ψO的合成，rac-ψ的合成相對簡單，以環(huán)氧環(huán)己烷為原料類比ψ即可獲得。為此，作者對含有二硫代磷酸酯ψ2和天然磷酸二酯的ψO試劑的合成進行了探索（圖2）。盡管1995年化學(xué)家報道了二硫代磷烷（dithiaphospholanes）可以安裝在核苷上并與其偶聯(lián)，以合成含有二硫代磷酸酯連接結(jié)構(gòu)的二核苷酸，但是安裝硫需要單獨的氧化步驟以及有毒且不穩(wěn)定（爆炸性）的試劑（圖2A）。鑒于此，作者以去除氧化步驟和危險試劑為目的，選擇P(V)為中心來設(shè)計合成二硫代磷酸酯ψ2。在確定最佳離去基團與環(huán)大小兩個因素后，作者發(fā)現(xiàn)廉價的P2S5可以與五氟苯酚結(jié)合，然后用環(huán)硫乙烷與P(V)中間體（6）進行反應(yīng)，能夠大規(guī)模（>100 g）地合成含有二硫代磷酸酯結(jié)構(gòu)的ψ2（3）。類似地，作者評估了近30個不同骨架以及3個不同離去基團，其中骨架優(yōu)化系統(tǒng)地評估了環(huán)大小、取代基、電子效應(yīng)以及立體化學(xué)對位阻、偶聯(lián)和整體穩(wěn)定性的影響，并發(fā)現(xiàn)ψO是唯一可行的試劑。隨后，作者以簡單、可規(guī)?；?gt;50 g）的步驟合成了ψO試劑（圖2A）。具體而言，廉價的P2S5與4-溴苯硫酚進行反應(yīng)得到P(V)中間體（7），后者與氫化cis-檸檬烯環(huán)氧化物（8）結(jié)合生成PS試劑（9），最后經(jīng)SeO2脫硫便可獲得ψO（5）。

接下來，作者將P(V)平臺與目前最先進的P(III)方法進行了比較（圖2B），結(jié)果顯示P(V)平臺比P(III)方法步驟更簡便、產(chǎn)物純度更高（>99%）且不會產(chǎn)生PS雜質(zhì)。為了進一步測試和對比兩個平臺的優(yōu)缺點，作者對混合PO-PS主鏈的合成進行了探索。以P(III)方法為例，PS二聚體（13）與PA-dT（18）發(fā)生亞磷酰胺偶聯(lián)反應(yīng)得到被保護的三聚體（14），后者經(jīng)氧化得到目標(biāo)產(chǎn)物和脫硫副產(chǎn)物的混合物。相比之下，使用氧化還原中性P(V)方法則能夠成功地制備未保護的混合PS-PO三聚體（19），同時沒有任何硫損失。

這種P(V)方法要面臨的另一個大挑戰(zhàn)是能否克服經(jīng)典P(V)試劑較慢的偶聯(lián)速率問題，以適應(yīng)傳統(tǒng)的自動化寡核苷酸合成方案。作者基于P(V)全套試劑，采用動力學(xué)研究評估了P(V)平臺的偶聯(lián)性能，結(jié)果顯示經(jīng)典的基于P(V)的磷酸三酯方法非常緩慢（圖2C，橙色條），而本文詳述的P(V)試劑平臺與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)P(III)方案的性能相同，所有反應(yīng)均在兩分鐘內(nèi)達到完全轉(zhuǎn)化。

在過去的30多年里，基于亞磷酰胺合成的SPOS方法得到了不斷優(yōu)化。盡管其中一些方法或許也可繼續(xù)使用，但在某些方面現(xiàn)有解決方案與P(V)合成方法并不兼容（圖3A）。目前，通用的載體對于1,8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一碳-7-烯（DBU）不夠穩(wěn)定，為此作者使用 Pya 保護基代替標(biāo)準(zhǔn)的酰胺保護基，開發(fā)了一種穩(wěn)定性顯著改善的通用載體（20，圖3B）。同時，當(dāng)對胸苷使用Pom保護時，也獲得了更好的結(jié)果。其次，作者在確定所有P(V)試劑的化學(xué)選擇性和相對偶聯(lián)速率后，對氧化還原中性P(V)平臺在自動化 SPOS 上的效率進行了系統(tǒng)的研究。第一步，樹脂結(jié)合核苷的DMT基團去保護得到游離的5?-醇，后者與P(V)的核苷酸進行反應(yīng)，隨后發(fā)生封蓋和解封步驟完成了固相循環(huán)，并為下一次偶聯(lián)奠定了基礎(chǔ)。

接下來就是合成的實戰(zhàn)檢驗。任何新試劑系統(tǒng)要用于寡核苷酸合成平臺，必須先證明在使用單一方案制備不同序列的情況下仍能保持高保真度和穩(wěn)健性。為了檢驗新P(V)平臺的成色，作者設(shè)計了一種寡核苷酸分子結(jié)構(gòu)“矩陣”，以將所有可能的核堿基（A、C、G、T）和糖（DNA和LNA）組合引入到3-10-3 DNA/LNA gapmer框架上，這也是目前RNase H激活反義寡核苷酸中最先進的技術(shù)（圖3C）。無論P(V)單體是用于評估該方法的通用性還是用于序列特異性優(yōu)化，作者使用的均是單一方案。首先，作者測試了這種方法的通用性，合成了具有交替（21, 22）和連續(xù)立體化學(xué)結(jié)構(gòu)（23-26）的均質(zhì)、手性PS-ASO。值得一提的是，這種使用氧化還原中性P(V)基試劑的方法是第二個工業(yè)上可行的生產(chǎn)立體純PS-ASO的平臺。隨著這一重要目標(biāo)的達成，作者開始將 PO2 連接結(jié)構(gòu)引入這些分子結(jié)構(gòu)中，以高純度獲得了嵌合序列（27-30），合成過程中硫沒有實質(zhì)性的損失。接下來，作者制備了同時帶有PS和 PS2連接結(jié)構(gòu)（31-34）的寡核苷酸序列以及含有所有四種可能連接結(jié)構(gòu)的寡核苷酸序列（35, 36）。最后，為了證明這種P(V)寡核苷酸合成平臺的優(yōu)勢，作者基于ψ 的衍生物rac-ψ（圖1），在該平臺上合成了外消旋PS寡核苷酸（37、38）（圖3D）。

總結(jié)

寡核苷酸療法能夠直接調(diào)控基因表達，被認(rèn)為是繼小分子藥物和蛋白質(zhì)類藥物之后的新一類藥物開發(fā)熱點方向。迄今為止，已被研究的寡核苷酸修飾數(shù)量十分有限，在臨床中的應(yīng)用甚至更少，說到底，原因還是在于合成水平跟不上。基于P(V)試劑合成寡核苷酸早已有之，但由于化學(xué)選擇性低及反應(yīng)性差等問題而無法擔(dān)當(dāng)大任。Baran教授等人的這項工作可以說使P(V)策略煥發(fā)新生，讓人們獲得希望的寡核苷酸嵌合序列成為可能。更有意義的是，這一P(V)平臺兼容商用的寡核苷酸自動化固相合成系統(tǒng)，應(yīng)用前景光明。盡管該平臺分離收率（12-27%）還不算太高，但經(jīng)過一定的優(yōu)化，未來應(yīng)該也不會是太大問題，即便在現(xiàn)在，這個水平的收率也足以支持藥物化學(xué)的實驗室研究。